We have developed a high-throughput system for single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping of alleles of diverse blood group systems exploiting Luminex technology. The method uses specific oligonucleotide probes coupled to a specific array of fluorescent microspheres and is designed for typing Jk(a)/Jk(b), Fy(a)/Fy(b), S/s, K/k, Kp(a)/Kp(b), Js(a)/Js(b), Co(a)/Co(b) and Lu(a)/Lu(b) alleles. Briefly, two multiplex PCR reactions (PCR I and PCR II) according to the laboratory specific needs are set up. PCR I amplifies the alleles tested routinely, namely Jk(a)/Jk(b), Fy(a)/Fy(b), S/s, and K/k. PCR II amplifies those alleles that are typed less frequently. Biotinylated PCR products are hybridized in a single multiplex assay with the corresponding probe mixture. After incubation with R-phycoerythrin-conjugated streptavidin, the emitted fluorescence is analyzed with Luminex 100. So far, we have typed more than 2,000 subjects, 493 of whom with multiplex assay, and there have been no discrepancies with the serology results other than null and/or weak phenotypes. The cost of consumables and reagents for typing a single biallelic pair per sample is less than EUR 3.-, not including DNA extraction costs. The capability to perform multiplexed reactions makes the method markedly suitable for mass screening of red blood cell alleles. This genotyping approach represents an important tool in transfusion medicine.
Basierend auf der Luminex-Technologie haben wir ein System mit hohem Durchsatz zur Genotypisierung von «single nucleotide polymorphisms» (SNPs) von Allelen verschiedener Blutgruppensysteme entwickelt. Das Verfahren verwendet spezifische Oligonukleotid-Sonden, die an fluoreszierende «Beads» gekoppelt sind, und eignet sich somit für die Typisierung von Jka/Jkb− Fya/Fyb−, S/s−, K/k−, Kpa/Kpb−, Jsa/Jsb−, Coa/Cob− und Lua/Lub-Allelen. Kurz zusammengefasst besteht das Verfahren aus zwei Multiplex-PCR-Reaktionen (PCR I und PCR II), die entsprechend an die speziellen Bedürfnisse des ausführenden Labors angepasst werden können. PCR I amplifiziert Allele, die routinemäßig getestet werden (Jka/Jkb, Fya/ Fyb, S/s und K/k). PCR II amplifiziert solche Allele, die weniger häufig typisiert werden. Die biotinylierten PCR-Produkte werden in einem einzigen Multiplex-Assay mit der korrespondierenden Sondenmixtur hybridisiert. Nach der Inkubation mit R-Phycoerythrin-konjugiertem Strep-tavidin wird die emittierte Fluoreszenz mithilfe des Luminex 100 analysiert. Bislang haben wir 2000 Personen typisiert, 493 davon mit dem Multiplex-Assay. Dabei gab es abgesehen von Null- und/oder Weak-Phänotypen keine Diskrepanzen zu den serologischen Ergebnissen. Die Kosten der Verbrauchsmaterialien und Reagenzien für die Typisierung eines einzelnen biallelischen Paars pro liegen unter 3,- EUR (DNA-Extraktionskosten nicht eingeschlossen). Auf Grund des Multiplexings ist diese Methode hervorragend für ein Massen-Screening von Erythrozyten-Allelen geeignet. Dieser Genotypisierungs-ansatz ist stellt ein wichtiges Werkzeug für die Transfusionsmedizin dar.